Capítulo 04: Herramientas biotecnológicas.

4.1 Proceso de fermentación.

Por motivos históricos, el término “procesos fermentativos” aún se usa en biotecnología para referirse a cualquier proceso microbiano realizado a gran escala, sea este una fermentación o no. Fermentación es un proceso anaeróbico o parcialmente anaeróbico donde carbohidratos o compuestos relacionados son oxidados para producir energía. Aunque los microorganismos no se identificaron como agentes de contaminación de alimentos hasta el siglo diecinueve, la fabricación de vinos, panes, quesos han sido practicados por más de 400 años.


Es probable que los alimentos producidos por actividad microbiana fueran descubiertos por accidente. Pasteur reconoció la importancia de los microorganismos en la contaminación de los vinos y Appert fue el primero en utilizar calor para destruir organismos en la industria de enlatados.

Actualmente, las fermentaciones se aplican tanto en la producción de alimentos y aditivos, productos químicos y medicamentos, como en el tratamiento ambiental.

Ya sean tradicionales o renovados por las posibilidades de la manipulación genética, los bioprocesos o “fermentaciones” persiguen uno de los siguientes objetivos: multiplicación de microorganismos para la obtención de biomasa (por ejemplo levaduras, los rizobios que son bacterias que fijan el nitrógeno al suelo, proteína unicelular entre otros); obtención de productos microbianos (antibióticos, aditivos, alcohol, enzimas, etcétera); conversión de una sustancia en otra por acción de microorganismos o enzimas (transformación de esteroides, isomerización de glucosa a fructosa, etcétera); limpieza de un solvente (tratamiento de efluentes, transformación de un contaminante en alguna sustancia fácilmente degradable, etcétera).

Un proceso fermentativo comienza con la elección del agente biológico adecuado (microorganismo o enzima), continúa con la transformación de la materia prima, en condiciones que pueden exigir esterilización, aireación y control del proceso (pH, temperatura, etc.), y finaliza con la separación y purificación del producto final.

Otras características que el microorganismo debe tener son las siguientes:

· Debe ser capaz de crecer rápidamente en el sustrato y ambiente adecuado, y de cultivarse fácilmente en grandes cantidades.

· Debe ser capaz de mantener constancia fisiológica bajo las condiciones de cultivo y producir abundantemente las enzimas esenciales para que ocurran los cambios deseados.

· Las condiciones requeridas para crecimiento máximo y producción de alimento deben ser simples.

La mayoría de los alimentos preparados utilizando microorganismos son alimentos fermentados. Los microorganismos que predominan en la fermentación para la producción de un alimento son levaduras y bacterias ácido lácticas, principalmente miembros del género Saccharomyces, Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus y Pediococcus respectivamente. Algunos alimentos como el vinagre son producidos por la combinación de organismos fermentativos y bacterias oxidativas.

Figura 1: Proceso industrial


Sin embargo, el proceso realizado puede variar dependiendo del tipo de producto que se quiera formar. Por ejemplo, la técnica convencional de fermentación de vegetales, que generalmente utiliza la industria, es bastante empírica y se basa en la fermentación espontánea debida a la carga microbiana que lleva el producto. El crecimiento microbiano durante este proceso ha sido dividido en cuatro etapas bien definidas:

· Iniciación, que suele incluir el desarrollo de muchos microorganismos Gram-negativos y Gram-positivos presentes originalmente en los vegetales y en todo tipo de material en contacto con éstos.

· Fermentación primaria, que implica crecimiento de bacterias acido lácticas con o sin desarrollo de levaduras fermentativas.

· Fermentación secundaria, que se caracteriza por el crecimiento de levaduras fermentativas a partir de la materia fermentable que permanece después de que el desarrollo de las bacterias acido lácticas resulta inhibido por los bajos valores de pH.

· Post-fermentación, que tiene lugar después de consumirse la materia fermentable y se caracteriza, en general, por el crecimiento de microorganismos oxidativos en la superficie de la salmuera (Incorporar sal) cuando ésta se encuentra expuesta a la atmósfera.

Las bacterias acido lácticas proliferan durante las fases de iniciación y fermentación primaria, dependiendo de su presencia en el producto original y de las condiciones químicas y ambientales bajo las cuales se mantiene el producto después de la adición de sal o salmuera.

El ácido láctico, o ácido 2-hidroxi-propanoico, es utilizado en varios productos como regulador de acidez. Se produce a partir del ácido pirúvico a través de la enzima durante el proceso de fermentación.


4.1.1 Mecanismo bioquímico de la fermentación.

A pesar de que la fermentación es producida por un microorganismo, el mecanismo mediante el cual esta se lleva a cabo es químico. Este mecanismo bioquímico, también llamado metabolismo, son un conjunto de reacciones químicas de degradación (catabolismo) y de síntesis (anabolismo) de sustancias esenciales para el microorganismo.

Las vías catabólicas, por ejemplo, ocurre una degradación de compuestos orgánicos en moléculas más pequeñas, liberando energía; una parte de esta energía se almacenada en la forma de ATP (trifosfato de adenosina), y la restante se disipará como calor. Las principales vías catabólicas son la respiración y la fermentación.


4.1.2 Metabolismo de los azucares.


a. Por bacterias.

Un proceso fundamental en los microorganismos es la descomposición de un carbohidrato (principalmente glucosa, fructosa y sacarosa), siendo las bacterias acidolácticas las más importantes. Estas bacterias pueden metabolizar los azúcares siguiendo dos rutas importantes.

Las bacterias homofermentativas u homolácticas.

Estas metabolizan las hexosas a través de la ruta glucolítica o vía de Embden-Meyerhof, para dar ácido láctico casi exclusivamente como producto final. Se producen dos moles de ATP por mol de hexosa fermentada y no hay producción neta de poder reductor ya que el NADH producido en la transformación de la triosafosfato a piruvato se consume posteriormente en la reducción del piruvato a lactate. La reacción global es:

Glucosa (o Fructosa) g 2 Láctico


Las bacterias heterofermentativas o heterolácticas.

Estas bacterias al carecer de la enzima aldolasa, producen, a partir de un mol de glucosa, un mol de ácido láctico, un mol de etanol (o ácido acético) y un mol de anhídrido carbónico (CO2). En esta ruta, se produce un mol de ATP por mol de hexosa fermentada. Aquí se originan tres moles de NADH. Para recuperar el equilibrio redox, un mol se oxida en la etapa de reducción del piruvato y, si no existen aceptores de electrones alternativos, el acetilfosfato se reduce a etanol oxidándose los otros dos moles de NADH; si existen aceptores alternativos se forma ácido acético como producto final.

Glucosa ---> Láctico + Etanol + CO2


La fructosa también puede ser metabolizada a través de la ruta heterofermentativa de forma análoga a la glucosa, pero también puede funcionar como un aceptor de electrones adecuado llevando a cabo la oxidación del NADH; como resultado, una gran parte de la fructosa se reduce a manitol.

Se tienen ahora las siguientes reacciones globales:

3 Fructosa ---> 2 Manitol + Láctico + Acético + CO2


b. Por levadura.

Bioquímicamente, las levaduras metabolizan la glucosa siguiendo la ruta glucolítica hasta la formación de piruvato, pero, a diferencia con las bacterias acidolácticas y animales, las levaduras poseen la enzima piruvato descarboxilasa, que actúa sobre el piruvato para dar CO2 y acetaldehido; a continuación, el acetaldehido se puede reducir a etanol con oxidación del NADH a NAD+. En total se originan dos moles de ATP por mol de glucosa fermentada.

Glucosa ---> Etanol + CO2 + Energía


Las levaduras son cuerpos unicelulares (generalmente de forma esférica) de un tamaño que ronda los 2 a 4 μm y que están presentes de forma natural en algunos productos como las frutas, cereales y verduras. Son lo que se denominan: organismos anaeróbicos facultativos, es decir que pueden desarrollar sus funciones biológicas sin oxígeno. Se puede decir que el 96% de la producción de etanol la llevan a cabo hongos microscópicos, diferentes especies de levaduras, entre las que se encuentran principalmente Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces fragilis, Torulaspora y Zymomonas mobilis.

El etano o alcohol etílico es tóxico para los seres vivos y en altas concentraciones es letal para la levadura. Cuando el etanol alcanza aproximadamente el 15% en volumen, se produce la muerte de la levadura y, con ello, la fermentación cesa. Por este motivo, los vinos no suelen superar el 15% de graduación alcohólica.


4.2 Cultivos de células y tejidos.

Dado el incremento en la población mundial, la producción de alimentos es un importante reto para el futuro. Para lograrlo es necesario mejorar el rendimiento y productividad de los cultivos vegetales y animales, creando variedades mejoradas de plantas y animales que proporcionen alimentos de mejor calidad a más bajos costos.

En este punto debemos mencionar que la herramienta biotecnológica más útil es el cultivo in vitro, pero lo cierto es que las técnicas para el cultivo de tejido animal y vegetal han avanzado mucho. Esta forma de cultivar organismos tiene dos características fundamentales: la asepsia (ausencia de gérmenes, etc), y el control de los factores que afectan el crecimiento.


4.2.1 Micropropagación de plantas.

La reproducción asexual permite obtener un gran número de plántulas a partir de una única planta. Dependiendo del caso, se aprovechan bulbos (cebolla), cormos (gladiolo), rizomas (helechos), tubérculos (papa), tallos (banana), raíces (batata, manzana, mora), hojas (begonia, sansevieria o lengua de suegra), estacas (vides), etc.

Las plantas que resultan de la propagación asexual o vegetativa son idénticas a la planta madre e idénticas entre sí. En otras palabras, son clones. La capacidad de una célula de regenerar réplicas del organismo del cual deriva se denomina totipotencia. Esta propiedad es característica de las plantas, pero no de los animales. Según las condiciones fisiológicas y ambientales, las células vegetales se orientan hacia diferentes vías metabólicas.

La totipotencia permite la supervivencia de las plantas superiores, luego del ataque de herbívoros, plagas y patógenos o en condiciones ambientales desfavorables. Si bien los primeros intentos de cultivo de tejidos vegetales datan de 1902, la primera experiencia exitosa fue la germinación in vitro de semillas de orquídea. Transferidas asépticamente al medio de cultivo e incubadas en condiciones favorables, las semillas, y más tarde las plántulas, se mantuvieron protegidas del ataque de hongos y bacterias. Con algunas variaciones, el método aún es utilizado por numerosos floricultores, ya que las posibilidades de supervivencia de las plántulas de orquídea después de la germinación in vivo son muy bajas. Ello se debe al tamaño minúsculo de las semillas y a la ausencia de reservas nutritivas.



a. Etapas de la micropropagación in vitro.

La micropropagación se inicia a partir de explantos, es decir, pequeños fragmentos de tejido extraídos de diversas partes de la planta, tales como hojas, raíces, segmentos nodales y yemas axilares, florales y apicales. Los explantos se cultivan asépticamente en medios de composición adecuada, posibilitando la regeneración directa de la planta. Existen dos formas de extraer el explantos:

· El cultivo de meristemas. La regeneración de una planta puede ocurrir a partir de un órgano tan pequeño como la yema apical (0,5 a 2 mm). En ella, asociado a los primordios foliares y al tejido subapical, se encuentra un pequeño fragmento (0,01 a 0,3 mm) de meristema, un tejido embrionario a partir del cual se forman todos los otros tejidos de la planta. Por eso, el cultivo de la yema apical puede ser reemplazado por el de meristemas. Una manera de obtener plantas libres de virus y de otros patógenos es asociando el cultivo de meristemas con la termoterapia, que consiste en una incubación a 32-34 0C por un tiempo determinado (geranio, dalia, crisantemo, caña de azúcar, papa, frutilla, alcaucil, etc.). De esta manera se pueden recuperar plantas amenazadas de extinción por la contaminación con un virus y que solo se reproducen naturalmente de forma asexual.

· El cultivo de callos. El cultivo de callos es el método alternativo para las plantas que pueden propagarse directamente a partir de meristemas. Un callo es una masa de células desdiferenciadas que prolifera de manera irregular a partir de un explanto. Se trata de un tejido de tipo tumoral que se produce in vivo como respuesta a las heridas sufridas por los órganos y tejidos. Una vez establecido en un medio de cultivo, el callo puede subdividirse cada tres o cuatro semanas, manteniendo indefinidamente las células en un medio nutriente con la misma composición. Si el callo es transferido a medios con una concentración de hormonas diferente, se formarán órganos o embriones, a partir de los cuales podrán regenerarse numerosas plantas. Sin embargo, en el cultivo de callos la proliferación celular está acompañada por variaciones genéticas e inestabilidad cromosómica.

Una vez definido el tipo de explanto que se va utilizar, se procede a realizar la micropropagación, la cual comprende cuatro etapas.

· Etapa 1: establecimiento de un cultivo aséptico. Una vez retirados de la planta madre, los explantos se desinfectan con un agente químico, generalmente hipoclorito de sodio, que se retira más tarde por lavado. Los explantos se transfieren al medio de cultivo en condiciones asépticas similares a las utilizadas para el cultivo de microorganismos. La incubación se realiza a una temperatura entre 23 y 28 °C, recibiendo luz durante 12 a 14 horas diarias.

· Etapa 2: multiplicación. Los propágulos que se desarrollaron se transfieren a un medio de multiplicación, obteniéndose numerosos subcultivos. El medio de cultivo incluye agua, una fuente de carbono (azúcar), sustancias inorgánicas (sales minerales), vitaminas, hormonas y factores reguladores del crecimiento.

· Etapa 3: preparación de las plántulas para la transferencia al suelo. Las plántulas pasan del medio de multiplicación a un medio de enraizamiento donde, además de desarrollar raíces, adquieren vigor y comienzan la fotosíntesis.

· Etapa 4: aclimatación. Transferencia de las plantas, primero al suelo o a algún otro sustrato y más tarde a un invernadero. Protegidas de la luz solar directa, aumentarán su capacidad fotosintética adaptándose lentamente a las condiciones ambientales.


4.2.2 Manipulación in vitro de las células animales.

Aunque los primeros estudios datan de 1912, el cultivo de células animales comenzó a desarrollarse exitosamente recién en la década de 1950, cuando H. Eagle consiguió definir los nutrientes necesarios para el crecimiento celular. Básicamente, un medio para el cultivo de células animales incluye agua, sales minerales, aminoácidos, vitaminas, glucosa, suero bovino, de caballo o humano (factores de crecimiento) y antibióticos (para prevenir contaminaciones microbianas).

Las células deben aislarse, inocularse y mantenerse asépticamente en condiciones bastante estrictas de temperatura (35 a 37 0C), pH y humedad. Una de las primeras técnicas desarrolladas es el cultivo de leucocitos, que brinda en pocos días el número adecuado de células para el análisis del cariotipo. Este sirve para detectar las alteraciones cromosómicas estructurales y numéricas que puedan ser la causa de disturbios en el funcionamiento del organismo.

Los leucocitos extraídos del paciente se colocan en un medio líquido que induce la división celular. El agregado de colchicina inhibe la formación del huso mitótico, bloqueando la división celular en la metafase. Con un choque hipotónico se provoca la lisis de las células y la liberación de los cromosomas. Pero hay otros tipos de células de mamíferos que también se cultivan in vitro. Se pueden multiplicar células aisladas a partir de fibroblastos o de tejido epitelial en la superficie de un soporte inerte (vidrio, plástico, etc.), formando una monocapa. Transfiriendo algunas células a un medio nuevo (“repique”), un cultivo primario genera sucesivos cultivos secundarios.

A diferencia de los microorganismos que pueden ser repicados indefinidamente, las células animales sufren un tipo de muerte programada (apoptosis) después de aproximadamente unas cincuenta divisiones. Se debe entonces reiniciar el cultivo a partir de una nueva muestra. Existen algunas excepciones que escapan a esa limitación, como las células tumorales o las células madre, y también los linfocitos B inmortalizados por infección con el virus de Epstein-Barr o por fusión con células de mieloma (hibridomas).

a. Aplicaciones del cultivo in vitro de células de mamíferos.

En las colecciones de cultivos se encuentran líneas celulares de diversos tipos, conservadas por criopreservación. El cultivo in vitro de células animales se usa en la fabricación en gran escala de varios productos, tales como vacunas y anticuerpos monoclonales. También es adecuado para la producción de citoquinas (linfoquinas, interferones, eritropoyetina) y de otras proteínas de origen recombinante (factor activador del plasminógeno, por ejemplo) que, por requerir modificaciones postraduccionales complejas, no pueden ser producidas en bacterias o levaduras transformadas.

En el momento de pasar de la escala de laboratorio a la escala industrial, hay que tener en cuenta algunas consideraciones. El cultivo de células animales exige un cuidado extremo, además de condiciones muy controladas y de medios de cultivo caros y complejos. Las células son muy frágiles y sensibles a la ruptura.

La demanda de oxígeno es alta y como las células se multiplican lentamente (cada 20 horas aproximadamente), hay que mantener la asepsia durante períodos prolongados. Las concentraciones celulares resultantes son bajas, al igual que la productividad y la rentabilidad del proceso. Mientras algunas células pueden crecer libremente en suspensión, como los linfocitos, otras solo crecen sobre un soporte.


4.3 Tecnología del ADN.

La tecnología del ADN engloba una serie de procedimientos para extraer, cortar, sintetizar, marcar, identificar, amplificar y secuenciar el ADN. Estas técnicas, constituyen en la actualidad un conjunto de herramientas que es utilizado en forma rutinaria en los laboratorios, generalmente en sistemas automatizados especialmente diseñados para efectuar muy rápido un número altísimo de operaciones.


4.3.1 La extracción del ADN.

La extracción del ADN es un procedimiento relativamente simple. De un modo general, la ruptura de paredes y membranas libera el contenido celular, del cual se eliminan el ARN y las proteínas antes de separar el ADN, que precipita con alcohol. Una vez extraído y purificado, el ADN se trata de diversas maneras.


4.3.2 Corte del ADN

Entre las numerosas enzimas utilizadas diariamente en los laboratorios, las nucleasas merecen una atención especial. Estas enzimas rompen las uniones entre los nucleótidos de una cadena de ADN; algunas comienzan por los extremos, eliminándolos de a uno, otras cortan a la molécula por adentro. A este último grupo (endonucleasas) pertenecen las “enzimas de restricción”, que son capaces de cortar el ADN en sitios específicos.

Las enzimas de restricción son enzimas que reconocen y cortan las moléculas de ADN por secuencias nucleotídicas específicas. Aunque estas enzimas desempeñan una función propia en las células procariotas en las que se descubrieron, son particularmente importantes por su empleo experimental en varias áreas de la biología molecular, de interés tanto básico como aplicado al diagnóstico clínico; en especial, se utilizan en el proceso de clonación molecular del ADN. Además, tienen aplicación en otras técnicas como la secuenciación del genoma y el estudio de los polimorfismos.

Normalmente, las enzimas de restricción son producidas por bacterias, como un arma de defensa contra el ataque de virus (bacteriófagos), ya que al cortar el ADN viral impiden su multiplicación. El ADN bacteriano no es atacado por sus propias enzimas, ya sea porque no posee las secuencias correspondientes o porque las secuencias están camufladas por la adición de grupos metilo.

Figura 2 Algunas enzimas de restricción tipo II comunes, con sus secuencias de reconocimiento, los patrones de corte y su origen.


4.3.3 La electroforesis del ADN.

Los fragmentos de ADN que fueron obtenidos con enzimas de restricción pueden ser separados en un gel al cual se aplica un campo eléctrico. Al estar cargados negativamente, los fragmentos de ADN se desplazan hacia el polo positivo a una velocidad que depende del tamaño.

Fragmentos menores encuentran menos resistencia y migran más rápido. El poder de separación varía con el tipo de soporte (gel de agarosa o de poliacrilamida) y su concentración, porque esta determina el tamaño del poro. También depende de las características del campo eléctrico aplicado.

Los fragmentos de restricción forman bandas que se pueden observar a la luz ultravioleta, después de la tinción con una sustancia fluorescente. Junto con la muestra se siembra en el gel una mezcla de fragmentos de tamaño conocido o “regla molecular”, que sirve como patrón de comparación para estimar el tamaño de las bandas de tamaño desconocido. Una de las primeras aplicaciones de la electroforesis de los fragmentos de restricción fue el estudio de los polimorfismos. Un cambio (mutación) en el sitio de restricción de una molécula de ADN (como, por ejemplo, de GAATTC a GAACTC) origina fragmentos de tamaño diferente, denominados RFLP (del inglés, restriction fragment length polymorphisms). Utilizados como marcadores, los RFLP pueden ser estudiados como cualquier gen asociado a un carácter visible o una modificación bioquímica.

Electroforesis Horizontal


Electroforesis Vertical


Figura 3: Tipos de electroforesis


Figura 4: Electroforesis en gel de agarosa



4.3.4 Hibridación y sondas génicas.

En determinadas condiciones de temperatura, pH o concentración salina, las hebras de la doble hélice de ADN se separan. La separación es causada por la ruptura de los puentes de hidrógeno entre las bases complementarias. Al volver a las condiciones iniciales, esos enlaces se reestablecen y las hebras se asocian nuevamente.

La reacción de hibridación también ocurre entre hebras de ADN o de ARN de diferente origen y tamaño, siempre que tengan algunas secuencias complementarias. En función de esta propiedad se construyen fragmentos de unifilamentares de ADN o ARN de secuencia conocida, marcados con sustancias fluorescentes o radiactivas. Estos fragmentos se usan como sondas para reconocer la presencia de una secuencia complementaria en un cromosoma o en una hebra de ADN.

Figura 5: Hibridación de una sonda con la secuencia complementaria

Tipos de procesos de la biotecnología

Según Rendueles y Díaz (2014), hay tres tipos de procesos en los que la biotecnología se abre paso, a saber:


1. Procesos en los que se utilizan microorganismos.

Los procesos de producción con células o microorganismos se fundamentan en organismos como bacterias y levaduras. Incluyen cultivos celulares, que comprenden además tejidos u órganos. Por ejemplo, en la fase líquida se encuentran bebidas alcohólicas y ácidos orgánicos, entre otros. En el caso de la fase sólida, se tienen alimentos como el pan, lácteos fermentados y cárnicos.


2. Procesos de utilización de enzimas.

Emplear enzimas es común en los procesos industriales. El costo de la enzima constituye un porcentaje significativo de los egresos totales del proceso. Cabe destacar que aquellas operaciones que impliquen purificación industrial requieren de técnicas costosas, como cromatografía y electroforesis.

Se encuentran diversas aplicaciones, como la industria textil y los cueros. En el caso de la industria farmacéutica, se desarrollan variados medicamentos para trastornos de la digestión y ungüentos para traumatismos.


3. Procesos de aprovechamiento de materiales biológicos.

Este tipo de materiales de crecimiento vegetal o animal son muy empleados industrialmente. Es posible que algunos procesos de la biotecnología sean de hidrólisis y separación. Para hacer uso de ello, es vital estar al tanto del detalle de la estructura de cada material.


Retos para el futuro.

La biotecnología surge como una alternativa a otras operaciones menos sostenibles. Un aspecto esencial es la minimización del impacto ambiental. Ha permitido la generación de nuevos medicamentos que abordan necesidades médicas y combaten epidemias y enfermedades raras. Se presentan, al mismo tiempo, procesos industriales que utilizan materias primas renovables en lugar de petróleo crudo. Por ende, la biotecnología resultará rentable en los aspectos económicos, sociales y ambientales.



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